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VETERINÄR/209: Mit HighTech zur Eutergesundheit (Forschungsreport)


ForschungsReport Ernährung · Landwirtschaft · Verbraucherschutz 1/2008
Die Zeitschrift des Senats der Bundesforschungsanstalten

Mit HighTech zur Eutergesundheit
Forschungsverbünde untersuchen immunologische Schutzmechanismen des Euters des Rindes und deren genetische Grundlagen

Von Hans-Martin Seyfert, Christa Kühn und Manfred Schwerin (Dummerstorf)


Entzündungen des Euters (Mastitis) sind seit Jahrzehnten die häufigste und teuerste Krankheitsursache beim Milchrind. Zwei unterschiedliche deutsche Forschungsnetze, die beide vom Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) koordiniert werden, suchen nach neuen Lösungswegen aus dieser Problematik.


Der vom Bundesministerium für Bildung und Forschung sowie dem Forschungsverbund Biotechnologie e.V. geförderte MAS-Net-Verbund (im nationalen Forschungsprogramm "FUGATO") untersucht die molekularen Ursachen, die zu einer unterschiedlichen genetischen Anfälligkeit gegenüber Euterinfektionen führen. Damit soll ein züchterischer Beitrag zur Verbesserung der Eutergesundheit beim Rind möglich werden.

Die von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderte Forschergruppe FOR585 untersucht die immunphysiologischen Prinzipien der Pathogenabwehr im Euter, um neue Wege der Prophylaxe zu finden.

Beide Gruppen setzen modernste Methoden der strukturellen und funktionalen Genomanalyse ein.


Eine häufige und teure Krankheit

Die Mastitis der Kuh ist die teuerste Einzelerkrankung des Rindes in der Milchwirtschaft. Jährlich erkranken etwa 30% der Kühe an einer Mastitis - die Kosten belaufen sich auf mindestens 200 Euro je Krankheitsfall. Beim Rind werden die Infektionen durch ein Spektrum unterschiedlicher Bakterien und Pilze hervorgerufen. Verschiedene Erreger führen zu unterschiedlichem Krankheitsverlauf. Gram-positive Erreger, besonders Staphylococcus aureus, führen oft zu subklinisch verlaufenden, chronischen Infektionen, bei denen sich die Erreger in das Drüsengewebe einnisten. Diese chronischen Infektionen verursachen etwa 80% der wirtschaftlichen Gesamtschäden und bilden aufgrund möglicher Antibiotika-Rückstände in der Milch auch ein Problem für die Lebensmittelsicherheit. Gram-negative Erreger, wie der Artenkreis von Escherichia coli, führen hingegen meist zu heftigen Entzündungen des Euters der Kuh (Abb. 1). Die immunbiologischen Hintergründe für den Pathogen-spezifischen Krankheitsverlauf sind völlig unklar.


Mastitis beeinflusst Ertrag und Qualität der Milch

Mastitis mindert den Milchertrag. Bei schweren Entzündungen geht sie mit völligem Rückgang der Milchproduktion, Fieber und Schmerzen bei den Kühen einher. Aber auch milde verlaufende, chronische Entzündungen führen zur Ertragsminderung.

Darüber hinaus vermindern Entzündungen in der Milchdrüse auch die Qualität der Milch. Abwehrstoffe aus der Blutbahn gelangen in die Milchdrüse und in das Milch-bildende Gewebe. Dadurch werden das Aussehen, der pH-Wert, der Geschmack, die Verarbeitungseigenschaften und auch die Haltbarkeit der Milch beeinträchtigt. Zusätzlich werden auch Abwehrzellen in die Milch "gelockt". Dadurch steigt die Anzahl der körpereigenen Zellen von weniger als 100.000 Zellen je ml Milch kräftig an und erreicht bei akuten Entzündungen oft Werte zwischen 1 bis 10 Millionen Zellen je ml Milch. Deshalb wird der Zellgehalt der Milch routinemäßig gemessen und dient auch als Qualitätsparameter für das Produkt. Steigt die Zellzahl über 400.000 Zellen je ml Milch, so sinkt der Erlös aufgrund geminderter Auszahlungspreise für den Rohstoff Milch.


Weder Züchtung noch Vakzinierung erfolgreich

Die Häufigkeit der Mastitis-Erkrankungen hat sich über Jahrzehnte in Deutschland nur wenig verändert. Zwar zahlt sich verbesserte Melkhygiene aus, weil dadurch der Infektionsdruck gemindert wird, aber dennoch ist das Infektionsrisiko auch heute noch etwa so hoch wie vor zwanzig Jahren.

Resistenzzüchtungen gegen die Mastitis waren bislang nicht erfolgreich. Wenn man bedenkt, wie stark der Infektionsdruck von den Haltungs- und Melkbedingungen abhängt, und noch die Vielfalt der Mastitis auslösenden Pathogene hinzu nimmt, dann wird verständlich, weshalb es schwierig ist, die Eutergesundheit in der Milchrindpopulation durch züchterische Mittel zu verbessern.

Es ist verschiedentlich versucht worden, die Kühe durch Impfungen mit inaktivierten Keimen gegen Neuinfektionen zu schützen, bislang aber ohne durchschlagenden Erfolg. Wir beginnen erst jetzt, die Gründe hierfür zu verstehen.


Genomsequenzierung ab Basis für neue Forschungsansätze

Seit wenigen Jahren ist die vollständige Sequenz des Genoms der Kuh weitgehend verfügbar. Darauf aufbauend sind mit den DNA-Chips analytische Hilfsmittel entwickelt worden, die es ermöglichen, in einer Gewebeprobe alle bestimmten Situationen (z.B. "gesund" vs. "krank") oder Genotypen (z.B. "resistent" vs. "empfindlich") gleichzeitig zu ermitteln (Abb. 2). Neben diesen Verfahren der "Transkriptomanalyse" sind auch die Verfahren der "Proteomanalyse" entwickelt worden, mit denen die Gesamtheit der Proteine in einer Gewebeprobe erfasst werden. Weitere holistische Verfahren sind hinzugekommen.

Dies bietet ungeahnte Möglichkeiten. Bisher nahm man nur einen recht eingeschränkten Blick auf das Abwehrgeschehen im Euter wahr. Mit den neuen Methoden der holistischen Analysen ist es möglich, das Abwehrgeschehen unvoreingenommen zu analysieren.


MAS-Net: Die Suche nach Mastitis-Resistenzgenen

Die neuen Technologien der Genomanalyse und innovative statistische Modelle eröffnen die Möglichkeit, molekulargenetische Informationen mit konventionellen Zuchtmethoden im Rahmen einer Marker-assistierten-Selektion (MAS) zu verbinden. Voraussetzung ist jedoch, dass der genetische Hintergrund des unterschiedlichen Abwehrvermögens der Tiere gegenüber Mastitis bekannt ist. Dieses Wissen wird in dem Verbundprojekt "MAS-Net" erarbeitet. In diesem Forschungsnetzwerk arbeiten insgesamt zehn Forschergruppen aus fünf deutschen Universitäten, zwei außeruniversitären Forschungseinrichtungen und einem Rechenzentrum der Wirtschaft eng zusammen.

Frühere Ergebnisse hatten gezeigt, dass es auf verschiedenen Chromosomen des Rindes Bereiche gibt, die offensichtlich für ein unterschiedliches Abwehrvermögen gegenüber Mastitis verantwortlich sind. Interessanterweise beeinflussen diese Regionen aber auch andere Merkmale wie zum Beispiel den Milchfluss oder das Temperament der Tiere. Ist das Zufall oder liegt hier ein Schlüssel für die Mechanismen, mit denen sich eine Kuh gegen das Eindringen von Keimen in die Milchdrüse wehren kann? Dies wird im Projekt ergebnisoffen geprüft.

Studien über die grundlegenden Mechanismen der Mastitis haben häufig als Versuchsansatz den Vergleich "gesund/erkrankt". Kernstück des MAS-Net-Projekts sind hingegen gesunde Rinder, die sich in ihrer Veranlagung, an Mastitis zu erkranken, deutlich unterscheiden, obwohl sie eng verwandt sind. Im MAS-Net-Projekt ist es damit erstmals möglich, Tiere, die sich nur in ihrem Abwehrvermögen gegenüber Mastitis unterscheiden, noch vor der tatsächlichen Erkrankung zu vergleichen und durch gezielte Inokulation mit Mastitiserregern die Mechanismen zu identifizieren, die der unterschiedlichen Mastitisempfindlichkeit zu Grunde liegen.

Erste Untersuchungen zeigten, dass sich die Gruppen besonders anfälliger und besonders unempfänglicher Tiere unter identischen Umweltbedingungen in dem Merkmal "Anzahl Körperzellen in der Milch" deutlich unterschieden: Tiere, deren Markerformation auf eine genetisch bedingt höhere Abwehrfähigkeit gegenüber Mastitis hinwies, zeigten eine signifikant niedrigere Zellzahl in der Milch als Tiere aus der Gruppe, für die aus den Markerinformationen eine hohe Empfänglichkeit gegenüber Mastitis vorausgesagt worden war. Da bekannt ist, dass eine enge genetische Beziehung zwischen einem erhöhten Zellgehalt in der Milch und der Anfälligkeit gegenüber Mastitis besteht, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass die Vorauswahl der Tiere anhand von Markerprototypen erfolgreich war. Zudem wurde beobachtet, dass sich die beiden Gruppen nur unwesentlich in der Milchleistung unterschieden. Damit sind bereits die im Forschungsprojekt eingesetzten indirekten genetischen Marker auch für die tierzüchterische Praxis von großem Interesse.

Mit den gegenüber Mastitis besonders wenig anfälligen und besonders stark anfälligen, aber noch klinisch gesunden Kühen stehen für die weiteren Untersuchungen hochinformative Tiere zur Verfügung, welche die Entwicklung eines verbesserten, familienunabhängigen Gentests für Eutergesundheit ermöglichen. In ersten Untersuchungen der gesunden, jedoch hinsichtlich Eutergesundheit unterschiedlich veranlagten Färsen ergaben sich bereits Hinweise auf mögliche funktionale Hintergründe dieser unterschiedlichen Veranlagung. So wurden vergleichende Transkriptom-Analysen von fünf verschiedenen, mit dem Erregereintritt bzw. der Erregerabwehr verbundenen Eutergeweben (Zitzenkanal, Fürstenberg'sche Rosette, Drüsenzisterne, Parenchym, Lymphknoten) durchgeführt. Tiere, deren Markerinformation auf eine genetisch bedingt höhere Abwehrfähigkeit hinweist, hatten eine signifikant größere Anzahl immunrelevanter Gene mit höherem Expressionsniveau in der Fürstenberg'schen Rosette als Tiere, für die eine hohe Empfänglichkeit gegenüber Mastitis vorausgesagt worden war (Abb. 3). Die Fürstenberg'sche Rosette am Übergang des Zitzenkanals zur Zisterne ist der erste Ort der immunzellulären Abwehr im Euter. Eine erhöhte Erregerabwehr in diesem Bereich der Zitzenzisterne könnte auch indirekt mit der beobachteten geringeren Immunreaktivität in den nachgeordneten Lymphknoten des Euters in Beziehung stehen. Gegenwärtig werden die Gene, die den betroffenen Regelkreisen des Immunsystems zuzuordnen sind und die sich in der Region der eingesetzten indirekten genetischen Marker befinden, auf merkmalsassoziierte Varianten hin untersucht. Vor dem breiten Einsatz in der Rinderzucht müssen solche Genvarianten dann noch einen Test in mehreren unabhängigen Rinderpopulationen bestehen, um sicherzustellen, dass sie wirklich eine Beziehung zur genetisch bedingt unterschiedlichen Abwehrfähigkeit gegenüber Mastitis besitzen.


FOR585: Pathogen-spezifische Abwehrmechanismen

Dieser interdisziplinäre Forscherverbund untersucht Pathogen-spezifische Abwehrmechanismen der Milchdrüse sowie spezifische Virulenzmechanismen und -gene bedeutsamer Mastitiserreger. Kliniker der Universität München arbeiten zusammen mit Immunologen, Molekularbiologen, Biochemikern und Mikrobiologen, um die Regulation des Abwehrgeschehens im Euter der Kuh zu analysieren. Der Einsatz der modernen holistischen Verfahren der Transkriptom- und Proteomanalyse erfordert den Einsatz bestmöglich standardisierter Infektionsmodelle und Zellkultursysteme. Hierfür werden die Euter von gesunden, laktierenden Kühen mit Bakterienstämmen infiziert, die von Mastitis-erkrankten Eutern (vgl.Abb. 1) isoliert wurden. Neben diesem in vivo Infektionsmodell werden auch Molekülmuster der Pathogene charakterisiert, um einen Einblick in die Infektionsstrategien verschiedener Mastitiserreger zu gewinnen.

Hierfür isolieren die Biochemiker jene Moleküle der Bakterien, die von der Kuh als Pathogen-Signal erkannt werden. Diese Moleküle werden dann hinsichtlich ihres Aktivierungspotentials zur Stimulation der mammären Immunabwehr überprüft. Dafür werden sie in das Euter gesunder Kühe infundiert und ihre immunstimulatorische Wirkung gemessen. Feinanalysen der Modulation dieser immunstimulatorischen Eigenschaften dieser Moleküle werden auch in Gewebekulturen von Milch-bildenden Zellen durchgeführt. Besonderes Interesse gilt der Frage, wie bestimmte Arten von entzündungsauslösenden Bakterien die Immunabwehr des Euters umgehen und über lange Zeit als chronische Infektion im Euter persistieren können. Ein Verständnis dieser Mechanismen wäre eine wichtige Voraussetzung, um Abhilfe gegen subklinische, chronische Mastitis schaffen zu können.

Ziel der Untersuchungen ist es zunächst, ein möglichst umfangreiches Kataster von Mastitis-relevanten Genen des Rindes zu erstellen und das Zusammenwirken von Genprodukten im Hinblick auf Abwehrmechanismen in der Milchdrüse aufzudecken. Das Verständnis der molekularen Grundlagen von Infektions- und frühen Abwehrmechanismen in der Milchdrüse dient auch als Grundlage für die Definition neuer Parameter für das Merkmal 'Eutergesundheit'. Darüber hinaus können die Erkenntnisse auch zur Entwicklung neuer diagnostischer und therapeutischer Ansätze für den Krankheitskomplex Mastitis führen.

Erste Ergebnisse dieses Forschungsverbundes zeigen, dass ein Staphylococcus aureus-Stamm, der subklinische Mastitis verursacht, die Immunabwehr im Euter dadurch behindert, dass er die Aktivierung des Faktors NF-KB blockiert, einem wohlbekannten Hauptfaktor der Aktivierung von Immunschutz-Genen. Dieser Staphylococcus aureus-Keim kann die normalerweise nach einer Infektion erfolgende Synthese von keimtötenden Peptiden in der Milchdrüse unterbinden (Abb. 4).

Dieses Ergebnis gestattet nun, sehr gezielt nach jenen Mechanismen zu suchen, die für diese Blockade der Immunantwort verantwortlich sind. Möglicherweise bieten die hierfür verantwortlichen Mechanismen neue molekulare Ziele für innovative Therapieansätze.


Licht am Ende des Tunnels

Wenn auch trotz züchterischer und verbesserter veterinärhygienischer Maßnahmen die Häufigkeit der Mastitiserkrankungen in Deutschland in den letzten Jahrzehnten kaum abgenommen hat, ist dennoch zu erwarten, dass die Ergebnisse der beiden komplementären Forschungsansätze zur Minderung der Infektionshäufigkeit des Euters von Kühen beitragen werden. Identifizierte merkmalsassoziierte Genvarianten werden nach erfolgreicher Testung in unabhängigen Rinderpopulationen die Möglichkeit eröffnen, die Eutergesundheit beim Rind effizient durch Zucht zu verbessern.

Darüber hinaus hoffen die Forscher, dem Milcherzeuger Hinweise für verbesserte Prophylaxe, Diagnose und Therapie von Euterinfektionen an die Hand geben zu können.


FBN Dummersdorf
Prof. Dr. Hans-Martin Seyfert, PD Dr. Christa Kühn, Prof. Dr. Manfred Schwerin,
Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN),
Wilhelm-Stahl-Allee 2, 18196 Dummerstorf.
E-Mail: seyfert@fbn-dummerstorf.de


Bildunterschrift der im Schattenblick nicht veröffentlichten Abbildung der Originalpublikation:

Abb. 1: Kühe mit (rechts) und ohne (links) Mastitis. Infektionsexperimente mit asservierten Bakterienstämmen (hier mit einem Escherichia coli-Stamm) sind zur Erstellung aussagekräftiger Versuchsbedingungen unabdingbar.

Abb. 2: DNA-Mikroarray: 18.000 Gene auf einem Träger. RNA von infizierten (grün) und nicht infizierten Kontroll-Eutern (rot) wurde gemischt und über Nacht auf den Rinder-DNA-Chip hybridisiert. Die Signalstärken der einzelnen 'Spots' spiegeln die Menge der jeweiligen RNA wider.

Abb. 3: Gene, die in der DNA-Chip-Hybridisierung der beiden Eutergewebe Fürstenberg'sche Rosette und Lymphknoten unterschiedliche Expression zwischen gesunden taktierenden Färsen mit hoher bzw. geringer Mastistisanfälligkeit zeigen.

Abb. 4: Pathogene induzieren die Synthese von bakteriziden Peptiden. Gewebeschnitt eines mit E. coli infizierten Euters. Das Lingual Antibakterial Peptide (LAP) ist mit einem polyklonalen Antikörper grün sichtbar gemacht worden. Zellkerne erscheinen rot.


Diesen Artikel inclusive aller Abbildungen finden Sie im Internet im PDF-Format unter:
www.forschungsreport.de


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Quelle:
ForschungsReport Ernährung · Landwirtschaft · Verbraucherschutz
1/2008, Seite 26-29
Herausgeber:
Senat der Bundesforschungsanstalten im Geschäftsbereich des
Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz
Redaktion: Dr. Michael Welling
Geschäftsstelle des Senats der Bundesforschungsinstitute
c/o Johann Heinrich von Thünen-Institut
Bundesallee 50, 38116 Braunschweig
Tel.: 0531/596-1016, Fax: 0531/596-1099
E-Mail: michael.welling@vti.bund.de
Internet: www.forschungsreport.de, www.bmelv-forschung.de

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veröffentlicht im Schattenblick zum 23. Juli 2008